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生体模倣発生的アプローチを用いたヒト毛包の組織工学

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さて本日の投稿テーマは「生体模倣発生的アプローチを用いたヒト毛包の組織工学」と題して、世界的な学術オープンアクセス誌であるネイチャー・コミュニュケーションズ(Nature Communications) に、再生医療の第一人者である コリン A. ジャホダ(Colin A. Jahoda) & アンジェラ M.クリスチアーノ(Angela M. Christiano)博士らにより研究成果が掲載されたという話題です。


Tissue Engineering(ティッシュ・エンジニアリング)・・・日本では組織工学と呼ばれる新たな概念が、世界中の薄毛・若ハゲ諸兄たちを救うかもしれないのです。


2018年12月13日 世界的な学術オープンアクセス誌であるネイチャー・コミュニュケーションズ(Nature Communications) に、ある重要な論文が掲載され、世界中の脱毛症で苦しんでいる薄毛・若ハゲ諸兄たちを狂喜乱舞させたのです。

『参考資料』
ネイチャー・コミュニュケーションズ(Nature Communications) 公式webサイト
https://www.nature.com/ncomms/ (英語版)
https://www.natureasia.com/ja-jp/ncomms (日本語版)
ネイチャー・コミュニュケーションズ 公式webサイト 2018年12月(英語版)

Nature Communications は、生物学、物理学、化学および地球科学のあらゆる領域における高品質な研究を出版するオープンアクセスジャーナルです。

本誌に掲載される論文は、各分野の専門家にとって非常に意義のある重要な進歩を示したものです。


『参考資料』
2018年12月13日 論文(PDFファイル)
『Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach』
https://www.nature.com/articles/s41467-018-07579-y.pdf
ネイチャー

抽象

ヒト皮膚構築物(HSC)は、重大な皮膚損傷を有する患者に対して効果的な治療を提供し、そして皮膚疾患に対するヒト関連の薬物スクリーニングを可能にする可能性を有する。

しかしながら、毛包(HF)のような人工皮膚付属物をヒト皮膚構築物(HSC)に組み込むことは依然として大きな課題である。

ここでは、3D印刷された金型を使用してHF微小環境における細胞の生理学的3D組織を再現することによって、ヒト皮膚構築物(HSC)内での毛包(HF)の生成のためのバイオミメティック(生体模倣科学)アプローチを示します。

Lef -1の過剰発現真皮乳頭細胞(DPC)の活性化は、無傷のDPC転写シグネチャを回復し、HSCにおけるHF分化の効率を有意に高める。

さらに、生着前の有毛HSCの血管新生は、免疫不全マウスにおける効率的なヒトの毛髪成長を可能にする。

培養されたヒト細胞から全HFを再生する能力は、主要な満たされていない医学的必要性を表す慢性創傷と同様に、異なるタイプの脱毛症の医学的管理に変革的な影響を与えるであろう。


前書き

皮膚は、表皮、真皮、および皮下組織のコア組織を含む50を超えるさまざまな細胞型を含む複雑な臓器であり、血管系、感覚ニューロン、皮膚の免疫系、毛包などの付属器などの他のさまざまな成分も含みます。

毎年、600万人を超える患者が、火傷や外傷、慢性糖尿病性潰瘍、遺伝性水疱性皮膚疾患による重大な皮膚の損失や外観の悪化のために米国で入院しています1。

バイオエンジニアリングヒト皮膚構築物(HSC)を生成する能力は、これらの患者2のための有望な皮膚代替療法を提供し、皮膚疾患3を標的とするためのヒト関連薬物スクリーニングを可能にしました。

現在利用可能なHSCは依然として、体温調節、バリア機能、および創傷治癒において役割を果たす、貧弱な長期生存率およびHFなどの付属物の欠如を含む重大な制限を有する4。

私たちのグループは最近、HSCにおけるマイクロパターン誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の血管系への方法を確立することにより、皮膚移植片の生存率を改善しました5。

しかしながら、人工HSCへのHFの組み込みは依然として大きな課題であり、再生医療および前臨床薬物試験の可能性を制限している。

真皮乳頭細胞(DPC)は、HFの形態形成および循環に不可欠である高度に特殊化された間葉系細胞である。

以前の研究は、無傷のDPCと上皮細胞6の皮内移植を介してマウスの人間の毛髪の成長を誘導するための概念実証を示しています。

2Dインビトロ培養で増殖するときしかし、実現可能な治療戦略にこの概念を転換することは、DPCはの毛誘導性の逆説的な急速な損失に多くの課題を提起し、人間のDPC、多数を必要とする7、8。ケラチノサイト9との共培養、小分子8の使用、低酸素培養など、さまざまなアプローチがDPCの誘導特性を回復するために使用されてきました10。

我々は以前にDPCの3Dスフェロイド培養がそれらの無傷の転写サイン 7を部分的に回復できることを示した。

この方法により、DPCの毛髪誘導特性の変動性が高レベルであるために、本発明者らおよび他のグループ 11は、マウスにおいて培養DPCスフェロイドを用いてヒトの毛髪形成を誘導することができた。

システム生物学のアプローチを使用して、我々はまた潜在的にDPCs 7の髪の誘導転写シグネチャの完全な回復を達成するために使用することができる誘導DPCのアイデンティティのいくつかの遺伝子を一括して制御する転写因子であるマスターレギュレーター(MR)遺伝子を同定した。

同様に、我々は最近Jak阻害剤も直接培養12で処理されたDPCの髪の誘導性を回復することを報告しました。

無傷のDPCの同一性を回復するためのこれらの実質的なステップの後、HSCにおけるde novo HFの生成はDPC転写シグネチャの有意な再プログラミング、ならびに上皮 - 間葉および細胞外マトリックスなどの重要な微小環境手がかりの正確な再現を必要とする相互作用

本研究では、HF微小環境における細胞の生理的3D立体配座を再現することにより、HSC内でヒトHFを効果的に生成するための革新的なバイオミメティックアプローチを提示します。

:我々は、高アスペクト比(ヒトHFSため〜100の幅に対する長さの比を有する構造を作成するための3D印刷技術の固有の能力を活用13、ソフトリソグラフィなどの以前の微細加工技術では不可能でした)。

我々のアプローチは、生理学的に関連のある細胞外マトリックスにおけるDPCの制御可能な自己凝集性スフェロイド形成および上皮間葉相互作用の開始を可能にし、これはインビトロでHSCにおけるHF形成をもたらす。

さらに、毛包を有するHSCの血管新生は移植片の生存を増加させ、マウスにおける効率的なヒトの毛髪成長を可能にする。

本発明者らの方法は、培養ヒト細胞から完全にエクスビボで毛髪を有するHSCを実現可能に生成するための新規の生物工学的戦略を表す。


結果

HSCにおける細胞の3D空間配置の制御

マウスにおけるヒト表皮と接触するように配置されたとき、ヒトDPCスフェロイドは、デノボ毛髪形成を誘導する可能性を有する7、11。

しかし、スフェロイドをHSCに入れて培養を続けた場合、それらは数日かけてコラーゲンマトリックスに速やかに解離し、HFの形態形成に必要な表皮間葉相互作用を開始しませんでした(補足図 1)。

以前の研究14と一致して、この観察は、単純な人工HSCがHF形成を誘導するのに十分な生理学的微小環境を提供しないことを示した。

HSC内の細胞の空間配置を制御するために、直径、長さ、密度を調整可能なHF形状のエクステンションを含む3Dプリント技術と微細加工プラスチック金型を使用しました(図 1a、b)。

これらの型を使用して、真皮線維芽細胞(FB)を含有するI型コラーゲンゲル上に一連のマイクロウェルを作製した(図 1c)。

これらのマイクロウェル上にDPCを播種すると、マイクロウェルの底部に一晩で自発的な凝集体形成が生じた(図 1d、e)。

この方法は、マイクロウェルの直径を調整することによってDPC凝集体サイズの正確な制御を可能にした(図 1f)。

自発的な凝集体形成は、バーシカン(VCAN)およびアルカリホスファターゼ(ALP)活性の発現を回復させ、平滑筋アクチン(SMA)の発現を抑制した。

1g)これらの変化はFB凝集体では観察されず(図 1h)、これは本研究を通して陰性対照として用いた。

3Dプリンティングアプローチにより、cm 2あたり19および81 HFのような異なるHF密度を有するHSCを生成することが可能になり(図 1i)、3D再構築真皮においてin vivo様DPC表現型を達成することができた。

図1

ネイチャーイラスト001

HSCにおける毛包分化の誘導

細胞の生理学的立体配座を確立するために、本発明者らは真皮構築物上にケラチノサイト(KC)を播種し、細胞を沈降させてマイクロウェルを埋め、DPC凝集体を飲み込み(図 2a、b)、毛包のような単位(HFU)に似ています。

KC添加後のDPCにおけるALPの持続的な活性を確認した。全構築物の断面は、HFUの基部でALP活性を示し(図 2c、d)、ここで、ALP活性およびVCAN発現を有するDPC凝集体は、K5陽性KCによって囲まれていた(図 2e、f)。

表皮細胞と間葉細胞の生理学的近接性と立体配座を反映して、DPC凝集体の真上のKCは、培養2〜3日後にHF中のKCに似た分化形態を示した(図2g)。 2H)。

1週間3D皮膚構築物を培養すると、KCがケラチン5(K5)(外毛根鞘マーカー)、AE13、AE15およびK71(内毛根鞘マーカー)、およびK75(a)を含む特定の毛系統に分化した。

髄質およびコンパニオン層マーカー)(図 2i − 1)。

対照としてFB凝集体を用いて同じ実験を行った場合、KCは、K5の発現を保持することによって未分化状態のままであり、そしてヘア系統マーカー、AE13またはK75を発現することができなかった(図 2m、n)。

これらの分析では、卵胞構造内にオイルレッドO染色がないことから明らかなように、我々はKCの皮脂腺細胞系列への分化を観察しなかった(補足図 2)。


図2

ネイチャーイラスト002

培養期間をインビトロで1週間から3週間に延長すると、真皮へのHFの伸長および内側および外側ルートシース層のより良好な組織化がもたらされた(図 2o)。

興味深いことに、HFは、インビトロで3週間培養した後、それらの配向を最初の90度の角度からより生理学的な鈍角(> 120度)まで自発的に再配置した(図 2o)。

注目すべきことに、我々の構築物のいくつかにおいて、我々は、HSCの表面から突出する毛髪繊維を観察した(図 2p、q)。

この段階ではあるが、このプロセスは比較的非効率的であり、3つの構成体のうちのおよそ1つでしか観察されなかった。

しかしながら、我々の知る限りでは、これは完全にエクスビボの文脈でのHSCにおけるヒトHFの生成の最初の実証である。


遺伝子リプログラミングによるHF誘導の改善

我々のHSCにおいて、我々はHFの分化を示すHFUの総HFU数(成功率)に対する比率が19%と低いことを発見した。

これはおそらくDPC毛髪誘導遺伝子シグネチャの不完全な修復(約22%)によるものであろう。 3D集合体形成7によってのみ達成される。

したがって、さらに毛髪の誘導性を高めるために、我々は2つのMR遺伝子、活用レフ-1及びFLI-1 、我々は以前に、無傷のDPC遺伝子シグネチャーの重要な調節因子として同定され、7。興味深いことに、我々の以前のシステム生物学的アプローチは、DPCのスフェロイド培養およびFli-1過剰発現の両方が非常に類似した発現プロファイルを回復したことを示した7。

対照的に、Lef - 1はスフェロイド培養によって回復されなかった遺伝子を標的とし、Lef - 1過剰発現およびスフェロイド培養はDPC毛髪誘導転写シグネチャの回復に相補的であることを示唆している。

この仮説をテストするために、我々は、一過性トランスフェクションを行っレフ-1培養のDPCにおける(継代3)(補足図 3を用いて)、次いで形成されたスフェロイドをレフ-1トランスフェ細胞。

我々は、それらの遺伝子発現プロファイルを、空のベクター対照をトランスフェクトしたDPC、ならびにRNA配列決定を使用して新たに単離したDPと比較した。

レフ-1 ARACNEアルゴリズムによって以前に予測された下流のネットワーク遺伝子は、実験の過剰発現によって確認したレフ-1 3.45の正規化された富化スコア(NES)を得、遺伝子集合濃縮解析(GSEA)を介して培養のDPC及びPの値(二-tailed のt検定)2.8×10 -4(図 3A)。

遺伝子距離行列(図 3b)および階層的クラスタリング分析(補足図 4)は、Lef - 1過剰発現および3Dスフェロイド培養が、無傷のDPC遺伝子サインを相乗的に回復させることを示した。

Lef -1を過剰発現するDPCを用いて作製された皮膚構築物は、外側および内側の根の鞘(K17、K71、K25)を含む特定の髪系譜遺伝子、ならびに髪のコンパニオンおよび髄質の発現の有意な増加(最大13倍)をもたらした。

空のベクターでトランスフェクトしたDPCと比較したマーカー(K75)(図 3c)。FB凝集体を用いて作製したHSCは、予想通り、内毛根鞘遺伝子、K71およびK25の発現を全く示さなかった。

図3cにおける倍数差は 、空ベクターをトランスフェクトしたDPCに基づいて、HSCにおける遺伝子の発現に対して正規化した。

同様に、DPCにおけるLef -1過剰発現は、KC分化を伴うHFUのパーセンテージを著しく増加させ(図 3d)、HF誘導マーカーの成功率を19から70%に増加させた(図 3e、f、i)。

図3


ネイチャーイラスト003

外因的にLef-1の役割を再現するために、我々は組換えヒトWnt10bおよびCHIR99021、GSK3の阻害を通してWntシグナル伝達を活性化する小分子で構築物を処理した。

(Lef - 1過剰発現の代わりに)これらの因子による治療もまた、Lef - 1過剰発現で達成されるよりも低いが、成功率を〜50%まで増加させ、細胞初期化のWntシグナル伝達非依存性役割を強調した(図3g)。 −i)。

他のMR遺伝子、Fli-1の外因性発現は、培養DPCにおける遺伝子発現の有意な初期化をもたらし(補足図 5a)、そしてコラーゲン5(COL5)およびコラーゲン6 などのいくつかのFli-1下流ネットワーク遺伝子をアップレギュレートした。

我々の以前の遺伝子ネットワーク分析と一致して、COL 6)(補足図 5b)。

がFLI-1のDPCにおける過剰発現するHSC(補足図で誘起HF分化 5C)21%の成功率と、それはかなり空ベクターでトランスフェクトのDPC(図ことによって達成誘導改善しなかった 3iの)。全体的に、これらのデータは、当社の以前の予測サポートFLI-1に対し、過剰発現およびスフェロイド形成は、DPCの再プログラミングに重複効果を持つレフ-1の過剰発現は、凝集体形成を補完し、大幅にDPCの毛の誘導性の回復を向上させることを。


卵胞密度の高い血管化HSCの生成

我々は次に、それらを免疫不全ヌードマウスに移植することによってインビボでヒトの毛髪を成長させるための、Lef− 1をトランスフェクトしたDPCを含む我々のHSCの能力を調べた。

人間の頭皮13の生理的な髪の密度をより厳密に再現するために、3Dプリントした高密度HFモールドを使用して、HF密度を81 HFからcm 2あたり255 HFに増加させました(図 4a-cおよび補足ムービー 1)。

実験の最初の組は毛髪形成をもたらさなかった。代わりに、我々は我々の以前の研究5と一致して、移植片における宿主血管新生の欠如のために移植片の中心で実質的な壊死を観察した(補足図 6a、b)。

図4

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血管床を形成するために、本発明者らは、皮膚線維芽細胞と共に、GFPタグ化ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を本発明者らのHSCの真皮に封入した(図 4d)。

HUVEC対FB比16:1で構築物を培養すると、真皮中に自発的な毛細血管形成が誘導された(図 4e)。

構築物の免疫蛍光ホールマウントイメージングは​​、これらの毛細管様構造がHFにごく近接していることを明らかにした(図 4d)。

血管新生したHSCをマウスに移植すると、移植片への宿主血管新生が促進された(図 4f)。

GFPタグ付きHUVECは、宿主赤血球およびマウス特異的ローダミン結合Isolectin Griffonia simplicifolia(GS - IB)で標識されたマウスの新たに形成された宿主血管に近接して位置し、移植時により組織化された細長いネットワークを形成した。4)(図 4g、h)、

そしてまた内腔形成を示した(図 4i)。


マウスに移植したHSCにおける発毛

免疫不全ヌードマウスに255HF / cm2の高い卵胞密度で我々の血管新生化HSCを移植した4〜5週間後、移植片において実質的な発毛が観察されたが、FB凝集体で調製したHSCは発毛を誘導しなかった(図5a)。 、b)。移植実験では、我々は条件ごとに10匹のマウスを使用した。

我々の血管新生戦略は、DPCを用いて調製したHSCおよびネガティブコントロールとしてのFBの両方について、10個の移植片のうち7個の移植片の生存を可能にした。

これら7匹のマウスのうち4匹からの移植片はヒトHFを首尾よく生成したが、FB対照実験における7匹のマウスのいずれも毛髪形成を誘導しなかった。

ヒト特異的核抗体による免疫染色は、これらのHFが、それぞれK71(図5c)およびVCAN(図 5d)染色によって示されるように、分化したヒトKCおよびDPCからなることを確認し た。

さらに、ネガティブSMAα染色によって証明されるように、人工HFの周囲に真皮鞘(DS)の存在を検出しなかった(補足図 7a)が、マウスの毛髪はLef - 1でマークしたDPCの周囲にSMAαの発現を示した(補足図)。 7b)。

これらのデータは、DPCとKCがDSの存在なしにde novo HFを成長させるのに十分であることを示唆しているが、DSは後期のHFの長期的な支援と維持に必要かもしれない。

ヒト特異的核染色およびK14(構築物の傾斜した角度のために染色が多層に現れる)の低倍率画像は、宿主と移植皮膚との間の縁を明確に描写し、そしてマウス皮膚の大部分の領域はHFを欠いた。

。 図5e)。私達の移植片はマウスよりわずかに厚い表皮しか持っていません、私達の移植戦略とタイミングと一致して、私達は移植前のHF分化との干渉を避けるために高カルシウム条件で表皮を角化しないことを選びました。

したがって、図5eに見られるさらなる表皮化および角化は マウスへの移植後に起こり、表皮分化は宿主微小環境によって制御され得ることを示唆している。

図5
ネイチャーイラスト005

毛髪繊維の顕微鏡明視野像は、人工毛髪(図5g)がヒトの終末毛髪の形態に非常に似ていることを示した (図 5f)。

さらに、それはヒトの終末毛と軟毛との間の中間の厚さを表していた(図 5h)。

de novo HFのヒト起源を確認するために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(補足図8a、b)を用いて移植片内のHFから細胞のRNAを選択的に単離し、 ヒト対マウス特異的プライマーを用いてPCRを行った(参照)。

補足表 1)15。両セットのプライマーを用いたPCR分析は、移植片中のHFがヒト特異的配列を高度に発現したのに対して、対照全マウス皮膚組織はマウス特異的遺伝子のみを発現したことを確認した(図5i)。

確かに人間の細胞から派生しています。我々はまた、ヒト特異的核染色に対して陰性である移植片中のいくつかの細胞の存在と一致して、HFにおける低レベルのマウス特異的遺伝子発現を観察した(図 5c-e)。

マウス特異的遺伝子発現のレベルは、レーザー捕捉HFと比較して移植片全体においてはるかに高かったので、これらの細胞は、HFの微小環境へのマウス血管系および浸潤細胞の動員を表している可能性がある(図 5i)。


討論

ヒトHFの組織工学は長年の課題であり、その進歩は血管系16や腸管上皮17のような他の実験室で成長した組織に遅れをとっています。

これは主に、毛髪新生に必要な細胞相互作用を維持するのに必要な微小環境的手がかりを首尾よく再現することができるプラットフォームの利用可能性の欠如によるものである。

:最近開発された3次元印刷技術は、高アスペクト比(〜100ヒトHFSのための幅に対する長さの比を有する構造の作成を可能にした13、ソフトリソグラフィなどの以前の微細加工技術では不可能でした)。

この機能を利用して、我々は、遺伝的に/外因的に再プログラムされた細胞を容易に生理学的に適切な立体構造に配置することができる3D再構築真皮中にHF様マイクロウェルを生成し、HFUを形成した。このバイオミメティックアプローチは、特定の毛髪系統へのKCの分化を導き、完全にex vivoの状況でHSC内にヒトHFを生成することを可能にした。

動物の体は動物/ヒト組織の発達および生着のための生理学的環境を提供するので、完全に再生された器官の最初の証明は典型的に動物への組織の移植を含む。

例えば、培養細胞から新たな成体のHFを作り出すことは1984年にさかのぼり、そこで培養されたげっ歯類のHF DPCはレシピエントの皮膚の毛の成長を誘導した18。同じグループは、文化19で再建された卵胞で育毛を達成した最初の人でした。

同様に、最近の2つの研究では、ヒドロゲル中にマウスiPS 細胞20またはマウス成人DPCおよび表皮細胞21をカプセル化し、続いてこれらのインビトロ条件付け構造をマウスに移植することにより、インビボでマウスの毛髪を成長させた。

別の最近の研究はまた、マウスiPS細胞の胚様体におけるHFの自発的形成を実証した22。

これらの成功にもかかわらず、ヒトとマウスのHFの間には、それらの毛周期、幹細胞特性、およびホルモン依存性だけでなく、それらの真皮細胞の毛髪誘導特性においても、著しい種間差異が存在する23。

1つの際立った違いは、培養されたげっ歯類のDPCはげっ歯類の皮膚に移植されたときに自己凝集することができることです24。

しかし、この凝集挙動はヒトDPCでは観察されていません25。Toyoshimaらの研究では、バルジ領域由来の上皮細胞と頭皮のHF由来の無傷のDPCを混合することにより、有毛胚様3D培養法を使用することにより、マウスにヒトHFが誘導された6。

この研究は、ヒトDPCがin vivoでHFを発生させることができるという価値ある概念実証を表した。

しかし、翻訳及び臨床現実にそのようなアプローチを拡張するために、これらの細胞はのDPCにおける毛誘導遺伝子サインの急速な喪失させるいくつかの通路、インビトロで展開されなければならない7、8。

我々は最近、細胞の3Dスフェロイド培養によってこの問題に対処し、それによって毛髪誘導性DPC遺伝子シグネチャの22%を回復した。その後、他のグループもマウスのHFを誘発するためにこの方法を使用することを報告したが、非効率的である11。

本研究では、毛髪誘導特性の効率を高めるために、HSCにおける自発的DPCスフェロイド形成と組み合わせてMR遺伝子Lef-1を過剰発現させることによって遺伝的および微小環境的再プログラミング戦略を組み合わせた。

空のベクターをトランスフェクトしたDPCを用いた場合のわずか19%と比較して、インビボ。

これらのHSCを血管新生化および移植することにより、マウスにおけるヒトHF形成の効率的な誘導がもたらされた。

本発明者らのMR戦略はインビトロで毛髪系統分化を有意に増強したが、完全に発達したヘアシャフトによる毛髪成長の効率はインビトロ培養HSCと比較して移植HSCにおいてはるかに高かった。

培養条件について 将来的には、適切な成長因子、小分子、または増殖促進剤を利用することで対処します。

組織工学によるヒトHFは、以下を含む多くの説得力のある用途を有する。

(i)全層皮膚喪失に対する皮膚補充療法。(ii)育毛手術。(iii)薬物開発のために毛髪疾患の動物モデルを代用/補完すること。(iv)化粧品の試験。

我々の方法は、HFSの自発的形成に依存して、以前のアプローチに比べていくつかの利点を有する6、22、特に卵胞のパターン及び密度を制御する能力の点で、十分な数を得拡張初代細胞(>継代3)を使用しますあらゆる種類の用途のための細胞の数。

例えば、全層皮膚移植を必要とする第三度熱傷患者のために、HFS以上の空間的制御は、移植部位で毛の密度の変化を再現容易にすることができる(例えばセンチメートルあたり292 HF 2センチメートルあたりの額vs.18のHF中2で前腕13)。

興味深いことに、Plikusら。最近、HFからのBMPシグナル伝達が筋線維芽細胞を脂肪細胞に変換し、創傷後の瘢痕形成を減少させる可能性がある26。

我々のHSCにおけるHFの存在は、創傷床における脂肪細胞分化を促進することによってこの機能を可能にするかもしれないが、これはさらなる調査を必要とする。

また、傷や非機能的な皮膚の形成は、一般的に貧弱な生存率およびHSCの統合に皮膚移植片で観察された27、28。有毛HSCを血管新生化する当社の能力は、皮膚組織と髪組織の両方の生存率を大幅に高め、再生性皮膚治療の革新的な革新を構成します。


ロボットによる毛髪修復術は、高精度かつ高速29の繰り返し操作を可能にすることで現代の毛髪移植に革命をもたらしました29。

男性と女性の型脱毛症を治療するための毛髪修復手術では、通常、患者1人当たり約2000本の移植片(約4400毛)を届けるのに100 cm 2のドナー組織部位が必要です。

当社の戦略を使用して、通常、0.5 cm 2という小さなドナー組織のストリップから1500万個のDPC(継代数3)を生成し、HSCで5000以上のHFを生成するのに十分なセルを生成します。

育毛療法。毛髪単位(1〜4本の毛)を集めるためのこれらのロボットシステムの改良は、一本の毛髪とは対照的に、1回の収穫あたりの毛髪の成長を著しく高めます30。3Dプリンティングアプローチを使用して、私たちの目標は、卵胞単位としておよび/または手術ロボットと統合することができ、効果的な毛髪移植手術を容易にすることができる所望のパターンでHFを設計することです。

さらに、技術的な観点からは、90度と比較して鈍角でHFを採取することはより困難であり、通常はより大きな切開が必要です31。

私たちの3Dプリンティングアプローチでは、90度の開始HF角度を使用しました。

これは、3週間の培養または皮膚移植の後、120度を超えるコンストラクト内で自己再編成されます。

しかしながら、毛髪修復用途のために、我々は、毛髪構造物中のHFUがそれらの調製後一週間で早く収穫され、表皮に対して垂直な直線的な切込みを有するHFを収穫するためのより実用的な出発材料を提供することを想像する。

HFの臓器培養は依然として、ヒトHFに対する薬物試験のための現在のゴールドスタンダードである。

この方法は、その低処理量、ヒトドナーからの新鮮な生きているHFへの依存、毛髪成長速度の広い個体間変動(異なるヒトドナーによる)のために標準化することが困難であること、真皮(例えば、真皮線維芽細胞および内皮細胞)、および培養物の短い寿命。設計されたHFをHSCに組み込む我々の能力は、これらの制限のいくつかを回避するための最初の大きな一歩を表している。

我々は現在、たった1つのHFドナー組織から始めて、6ウェルプレートフォーマットで255のHFを含む9つの皮膚構築物を作ることができ、これは薬物試験の処理能力面における実質的な改善である(器官型アッセイにおいて1:1)。

さらに、HFに対する真皮コンパートメントの寄与は、特に免疫細胞のような将来の他の真皮成分の添加によって潜在的に試験することができる。

我々のアプローチの直接の拡張の一つは、色素性HFを生成するためのメラニン細胞の取り込みです。

我々は以前iPSCからメラノサイトを導き出し、そしてそれらのメラニンを隣接するケラチノサイトに転移させるそれらの能力を示した32。

さらに、我々の分析では、我々はこれらの人工HFが毛周期を経験する能力を調べなかった。

それは我々のHSCにおける幹細胞の貯蔵所の存在と維持に依存している。最近、De Lucaのグループは、自己複製能の高い培養KCの亜集団である全クローン性表皮幹細胞33が、ヒトの表皮全体を再生できることを実証した34。

全クローン性表皮幹細胞を数回継代にわたって、そして長期間にわたってHSC内でフィーダーフリー環境に維持することができれば、翻訳目的のために人工HFに対してより大きな再生能力を提供することができる。

あるいは、HF幹細胞の組込み35、36またはのiPSC由来folliculogenic表皮細胞37別々のHSCには、潜在的に毛周期を確立することができます。

しかしながら、HF幹細胞を含むバルジ領域のような幹細胞ニッチを我々の構築物に加えることは細胞の空間制御においてより良い解像度を必要とし、それは我々の3D印刷型を用いる方法の現在の技術的限界である。

将来的には、単一細胞の解像度で動作する3Dバイオプリンティング技術は、循環および色素性HFを生成するために幹細胞およびメラノサイトなどの他の細胞型の包含を可能にするかもしれない。

最近の研究では、in vitroでの有毛成長にもかかわらず、in vitroでのマウス細胞の有毛オルガノイド形成は、有毛形態形成中に起こるものとは異なる自己組織化メカニズムに従うことが明らかにされた21。

この知見と一致して、本発明者らのアプローチは、発毛中の表皮 - 間葉相互作用を利用しながら、生理学的立体配座を合成的に誘導し、培養細胞の遺伝子シグネチャーを再構成してインビトロおよびマウスでヒトの発毛を誘導する。

私たちの新しいバイオミメティック発達組織工学戦略は、真に機能的な人間の肌を生み出す上での重要な一歩を表しており、肌やHFの障害に対する再生医療アプローチの劇的な概念的進歩を示しています。

毛髪研究者、毛髪修復外科医および製薬業界および化粧品業界によるこの新しい技術の適応は、この複雑なヒト組織の維持および再生において圧倒的な意味を持つであろう。


方法

細胞の単離と培養

新生児真皮ケラチノサイトおよび線維芽細胞をヒト包皮から単離し、CnT − 07(CELLnTEC)中で継代3(P.3)まで、および10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中でPまで培養した。

それぞれ5。GFPタグ付きHUVEC(Angio-proteomie)をクイックコーティング溶液(Angio-proteomie)でコーティングした組織培養フラスコで培養し、内皮細胞増殖培地(EGM、Angio-proteomie)で維持した。

顕微解剖38を使用して毛髪修復手術(Dr. Robert Bernsteinにより親切に提供された)から廃棄された頭皮組織からDPCを単離し、P.3 まで10%FBSを含むDMEM中で培養した。

全ての細胞型について培地を一日おきに交換した。細胞を37℃、5%CO2の加湿インキュベーター中に保った。


毛包パターンを有するHSCの生成

すべての3Dプリント金型は、CAD(コンピュータ支援設計)ソフトウェアであるSolidworksを使用して設計および描画されました。

金型上の各HF様延長部は、直径500μmおよび長さ4mmであった。様々な毛髪密度(19、81、255HF/ cm2)を有する型を、UV硬化材料VeroWhite(Stratasys)を使用するObjet24 3Dプリンタ(Stratasys)を使用して3D印刷した。

以前に記載された方法39と同様に、3D皮膚構築物を6ウェルプレートトランスウェルインサートで作製した。

1ml当たり1.25×105個の線維芽細胞を含有する4mLのI型コラーゲンマトリックスをトランスウェルインサートに添加することにより真皮区画を調製し、そしてゲルの上に配置された3D印刷HF型の周囲に37℃で30分間重合させた。

完全に重合した後、型を取り除き、1マイクロウェル当たり3000DPCを与える密度の100μlのDPC細胞懸濁液をゲルの上に加えた(例えば、1cm2当たり255HFに対して1ml当たり700万細胞)。

構築物を、凝集体形成のために10%FBSを含むDMEM中で一晩培養し、その後、100万個のKCをゲルの上に加えた。構築物を1〜3週間浸漬した低カルシウム表皮化培地39中に維持した。


HSCの血管新生

GFPタグ化HUVECをコラーゲンI型ゲル中に1mlあたり200万細胞の濃度で封入して、HUVEC対FBの比16:1を得た。

3Dプリントされた型を取り除いた後、HSCを最初に増殖因子(Lonza)を補充したEGM-2培地キット中に3日間静置して毛細血管を形成させた。

DPCおよびKC細胞播種は上記の通りに行った。EGM-2と表皮化培地の1:1混合物中で1日培養した後、構築物を画像化するか、または移植実験に使用した。


組織学、免疫染色、およびイメージング

免疫染色および組織学的染色のために、サンプルを半分に切断し、パラフィンワックス中に包埋するか、またはOCT溶液中で凍結保存した。ホルマリン(10%) -固定、パラフィンワックス包埋組織を切断した(20μm)をポリへのL -リジン被覆スライド、卒業エタノールシリーズを通してキシレン中で脱脂し、再水和し、55℃で一晩乾燥させた(100、95 、70%)および蒸留水(dH2O)。

試料をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で簡単にすすぎ洗いし、0.025%トリトン−X − 100を含有するPBS中の2%魚皮ゼラチン(Sigma)を用いて室温で90分間ブロッキングした。

試料を一次抗体(補足表2で使用された抗体および希釈液のリストを参照のこと)と共に4℃で一晩インキュベートした。

PBSで洗浄した後、試料をフルオロフォア結合二次抗体(ロバ抗ウサギ594、およびヤギ抗マウス488、1:700、Invitrogen)と共に室温で2時間インキュベートした。スライドを、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Vectashield)を含む封入剤を用いてカバーガラスで覆い、そしてZeiss LSM 5 Exciter共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて調べた。

製造者の指示に従ってVactaShield ALP活性キットを用いてALP染色を行った。

組織を一次抗体中で3日間、二次抗体中で一晩インキュベートしたことを除いて、切片の染色と同様に全載組織染色を行った。

イメージング前に、組織をベンジルアルコール:安息香酸ベンジル混合物(1:2)で清澄化した。


ヘマトキシリンおよびエオシン染色(H&E)

脱ロウした20μm切片を、室温で3分間、メイヤーのヘマトキシリン(Sigma)で染色した。水道水ですすぐことによって青色染色を行い、一方、1%酸性エタノールですすぐことによって分化を達成した。

対比染色は、エオシン(Sigma)で30秒間すすぎ洗いすることによって行い、脱水は、95%エタノール、100%エタノールおよびHisto-Clear(National Diagnostics)で順次洗浄することによって行った。

スライドをDPX(Agar Scientific)を含むカバーガラスで覆い、Zeiss Axioplan 2顕微鏡を用いて光学顕微鏡により調べた。


マウスへのHSC生着

全ての実験動物プロトコールは、コロンビア大学医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

8 - 10週齢の雄性免疫不全ヌードマウス(胸腺欠損ヌード、Crl:NU(NCr)-Foxn1n、チャールズリバー、ウィルミントン、MA)の背部前後正中線表面から0.8 cm 2の皮膚を除去した。

ピンチカット 直径1cmの高さのシリコン製チャンバーをマウスの裏側の皮膚の下に挿入した。

各マウスに1つのチャンバーのみを置いた。部屋は帽子の形をしていて、帽子の上に穴が開いていました。

HSCをチャンバーに入れ、そして表皮化培地を毎日チャンバーに添加することにより5日間維持した。

その後、チャンバーを取り除き、HSCを4本の縫合糸(7-0ナイロン)で、移植片の端の周りに簡単な断続的なパターンで固定しました。

その後、Bandaidをマウスの周りに巻き付け(OpSite Flexifix Transparent Film)、移植片を所定の位置に保持しました。

分析のために4〜6週間後にマウスを安楽死させた。

血管新生を可視化するために、マウスをマウス特異的ローダミン結合で尾静脈を介して静脈内注射したGS - IB 4(1:10; Invitrogen社)の前に安楽死溶液を20分間40。生着実験は、 1条件につき各生物学的複製物(n= 10)につき2匹のマウスに5つの生物学的複製物(別々のバッチのHSC)を用いて行った。


DPCのトランスフェクション
プラスミドpBABE-puro LEF1(Addgene、#27023)およびpCMV3-FLI1(Sino Biological、HG14507-UT)を購入した。

継代3のDPCを、1ウェルあたり100,000細胞で6ウェルプレートに播種し、トランスフェクションの前に一晩培養した。

リポフェクタミンP3000トランスフェクション試薬を用いて細胞をトランスフェクトした。各ウェルにおいて、細胞を2.5μgのDNAを含む250μlのP3000中で一晩維持し、そして培地をさらなる使用または分析のために通常の培地に交換した。


RNAシーケンス

製造業者の指示に従ってRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用することにより、示された条件に維持された細胞から全RNAを単離した。

9以上のRNA完全性番号(RIN)を受けた全RNAのみが、コロンビア大学の配列決定施設へのRNA配列決定に提出された。

サンプルは、サンプルあたり3000万回の読み取りで処理されました。配列決定分析のために、リードをヒト参照ゲノム(hg19)に整列させた。

HTSeqを用いて遺伝子数を計算し、DESeq(バージョン1.20.0)を用いた示差的遺伝子発現分析のための入力として用いた。

2D培養DPCを無傷のDPCと比較すると、0.05未満のp値(両側t検定)および2倍の変化を有する遺伝子をさらなる分析のために選択した。

ヒートマップおよび遺伝子距離行列にクラスター化されたサンプルの遺伝子発現データは、教師なし階層的遺伝子クラスタリング分析を使用して実施した。


遺伝子セット濃縮解析

我々は以前に、特定の領域内の標的の濃縮されたセットを有する転写因子を同定するために、Fisher's Exact TestおよびGSEAの両方を用いてパネル濃縮および差次的発現の関連について皮膚トランスクリプトームを調べることによってDPC遺伝子シグネチャーのMRを同定した。

ここでは、GSEAを使用して、ARACNEアルゴリズム7によって以前に検出されたLef -1標的遺伝子と、Lef -1トランスフェクトDPC におけるRNA配列決定によって実験的に見出された遺伝子発現データとを比較した。

NESおよびそれに関連するp値を計算するための帰無分布は、遺伝子順位付けを無作為化するためのラベルシャッフリングによって見出された。

次に、これらの無作為化集合を使用して、10,000回の反復にわたるヌルESを計算し、ヌル分布を生成しました。

観察された先端ESはこのヌル分布に対して正規化され、両側p値がこのNESに対して生成された。


リアルタイムPCRと統計解析

HSCからRNAを収集するために、RNA抽出の前に、組織全体を最初にTrizol中の超音波処理機によってホモジナイズした。

Invitrogenプロトコールに従い、そしてランダムヘキサマーとオリゴdTプライマーとの混合物と共にSuperScript IIIを使用して、RNAサンプルからcDNAを生成した。

Applied Biosystems 7300リアルタイムPCRシステムでSybr Green PCRミックスを用いてqPCRを実施した。

変化倍率はデルタ - デルタCTアルゴリズムを用いて計算した。

エラーバーは、3つの生物学的複製内の3つの技術的複製にわたるSDに基づいて計算した。

対応のない両側t検定を使用して、3つの技術的反復にわたる試料間の差が有意であるかどうか、またはp  <0.05であるかどうかを計算した。プライマー配列は補足表1で入手可能である 。


レーザーキャプチャー・マイクロ・ダイセクション

レーザーキャプチャー顕微解剖は、米国カリフォルニア州マウンテンビューに本拠を置く、Arcturus Engineering社(アークトゥルス・エンジニアリング)のレーザーキャプチャー顕微鏡を用いて、コロンビア大学癌センターのコア施設で行われた。

OCT包埋サンプルを膜スライド上で5μmの厚さに切片化し、75%エタノール中で固定し、そして顕微解剖41の前にキシレン中で脱水した。

捕捉された組織は直ちに溶解されそしてさらなるPCR分析のために調製された。


統計

ソフトウェアGraphPad Prismを用いて95%信頼区間で両側t検定を用いて、すべての実験について統計解析を行った。

我々は遺伝子組み換え組織において4つの異なる細胞型を用い、異なるドナー間で予想される変動性を用いたので、少なくとも3つの生物学的複製物および3つの技術的複製物を用いて適切なサンプルサイズを選択した。

特に、インビトロで毛髪構築物中のHF分化を確立するために行われた実験は、3人の異なるドナーの包皮由来の細胞(生物学的複製物)を用いて三重に行われた。

qPCR分析およびin vitroでの毛髪分化の成功率の定量化は三重にそして各条件について三つの生物学的複製で行われた。

インビボ成功率の計算のために、各 条件につき2つの生物学的複製物(n= 10)につき2つのマウスに5つの生物学的複製物(別々のバッチのHSC)を用いて生着実験を行い、合計20匹のマウスを得た。

毛髪再生成功率は、収穫時に生存していた血管移植片に基づいていた。

図3に示した成功率の定量化を行った研究者 は盲検化された。RNA配列データ収集は、Colorama Genome Centerの別の中核施設によって行われ、サンプルの条件に関する事前知識なしに分析された。

無作為化は使用されなかった。すべての統計学的分析について、p  <0.05は有意に異なると考えられ、ここで*p  <0.05および**p  <0.005であった。データは平均値±標準誤差として示した。


データの可用性

この研究の知見を裏付けるデータはこの原稿の中にあるか、または妥当な要求があれば対応する著者から入手可能である。

RNA-seqデータは、アクセッションコードGSE121112として GEOデータベースに提出されています。


追加情報

出版社のメモ: Springer Natureは、公開されている地図および所属機関の管轄権の主張に関しては中立を保っています。


それでは最初に、今回の研究成果が掲載されたネイチャー・コミュニュケーションズ(Nature Communications) についてです。


          ネイチャー・コミュニュケーションズ(Nature Communications)・ロゴ・マーク 













『参考資料』
ダラム大学(University of Durham) 公式webサイト
https://www.dur.ac.uk/
ダラム大学(University of Durham) 公式webサイト 2018年12月



『参考資料』
コロンビア大学 医科大学院 皮膚科(Columbia University Department of Dermatology) 公式webサイト
https://www.dermatology.columbia.edu/
コロンビア大学 医科大学院 皮膚科 公式webサイト 2018年12月









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